您好，歡迎來到上海研謹生物科技有限公司！
13585717991
021-65232515
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己烯雌酚快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物己烯雌酚的含量。
二、試劑盒特性
u試劑盒靈敏度： 0.1ppb
u 孵育溫度： 37℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
u 樣本檢測下限
組織（蝦、魚） ······························· 0.2 ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 ······························· 2 ppb
肌肉組織(方法二) ··························· 0.1 ppb
飼 料 ············································ 20ppb
尿 液 ··········································· 0.6ppb
u 交叉反應(yīng)率
己烯雌酚 ········································ 100%
雙烯雌酚 ········································ 38.5%
己烷雌酚 ········································ 8.5%
己炔雌二醇 ··································· ﹤0.1%
雌三醇 ········································· ﹤0.1%
u樣本回收率
飼 料 ·········································· 90±10%
組 織 ·········································· 85±10%
尿 液 ·········································· 70±10%
三、試劑盒組成
1 微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條
標(biāo)準液×6 瓶 0ppb 0.1ppb
2 0.3ppb 0.9ppb
（1ml/瓶）
2.7ppb 8.1ppb
3 酶標(biāo)記物 12ml 紅色帽
4 抗體工作液 7ml 藍色帽
5 底物 A 液 7ml 白色帽
6 底物 B 液 7ml 黑色帽
7 終止液 7ml 黃色帽
8 20X 濃縮洗滌液 40ml 白色帽
9 5X 濃縮復(fù)溶液 50ml 透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、
多道 30～300 µl
試 劑：乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷
酸（含量 85%）、乙酸乙酯
五、樣本前處理步驟
u樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配制：
配液 1 6M H3PO4 溶液
100ml 濃 H3PO4（含量 85%）加去離子
水 150ml 混合均勻。
配液 2 2M NaOH 溶液
8gNaOH 加去離子水 100ml 溶解。
配液 3 1M NaOH 溶液
4gNaOH 加去離子水 100ml 溶解。
配液 4 乙腈-丙酮混合液
V 乙腈-V 丙酮 = 4 : 1
配液 5 樣本復(fù)溶液：
將5X 濃縮復(fù)溶液用去離子水 1：4 稀釋。
u樣本處理：
（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法
1、稱取 2±0.05g 勻漿后的樣本，加入 6ml 乙腈-丙
酮混合液，震蕩 2min，15℃，4000r/min 以上，離心 10min。
2、取 3ml 上清液，60℃氮氣/空氣吹干。
3、加入 0.5ml 氯仿，渦動 20s，加入 2ml 2M NaOH，
渦動 30s，4000r/min 以上，離心 5min。
4、取 1ml 上清液，加入 200µl 6M H3PO4，渦動 5s。5、加入 3ml 乙腈萃取，振蕩 2min，室溫 4000r/min
以上，離心 10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。
6、用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻
30s。
不同樣本按如下方法稀釋：
1、 蝦魚：直接取 50µl 水相用于檢測。
2、 豬肉/肝、雞肉/肝：取 50µl 水相加入 450µl 樣
本復(fù)溶液，渦動混合 30s；取 50µl 用于檢測。
樣本的稀釋倍數(shù)：蝦魚稀釋倍數(shù)：2
豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：20
（b）肌肉組織處理方法二
1、稱取 2±0.05g 勻漿后的樣本，加入 2ml 2M
NaOH 溶液，震蕩 2min；2、加入 8ml 乙酸乙酯，劇烈震蕩 5min ；
3、 15℃，4000r/min 以上，離心 10min；
4、取 4ml 上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干；
5、用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻
30s。
樣本稀釋倍數(shù)：1
（c）飼料處理方法
1、稱取 2±0.05g 搗粹后的飼料樣本，加入 8ml 乙
腈，振搖 2min，15℃ 4000r/min 以上離心 10min；2、取 2ml 上清液，60℃氮氣/空氣吹干；
3、加入 0.5ml 氯仿，渦動 20s，加入 2ml 1M NaOH，
渦動 30s，4000r/min 以上，離心 5min；4、取 1ml 上清液，加入 100µl 6M H3PO4，渦動 5s；
不同樣本按如下方法稀釋：
1、 配合料：取 50µl，加入 950µl 樣本復(fù)溶液，渦
動混勻 30s，取 50µl 用于檢測。
2、 濃縮料/預(yù)混料：取 25µl，加入 975µl 樣本復(fù)溶液，渦動混勻 30s，取 50µl 用于檢測。
樣本稀釋倍數(shù)：
配合料稀釋倍數(shù)：100
濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：200
（d） 尿樣樣本處理方法
1、取 2ml 尿液到離心管中，室溫 4000r/min 以上，
離心 10min，直至清亮；2、移取 1ml 清亮尿液至離心管中，加入 1ml 1M
NaOH 強烈振蕩 5min；3、加入 100µl 6M H3PO4，渦動 30 s；
4、再加入 8ml 氯仿進行萃取，振蕩 5min。15℃，
4000r/min 以上離心 10min；
5、去掉上層的水相，取下層有機相 4 ml，60℃氮
氣/空氣吹干；6、用 3ml 樣本復(fù)溶液干燥的殘留物，混合 30s 7、取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：6
六、酶標(biāo)免疫分析程序:
u測定前應(yīng)須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u操作步驟：
1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放
入自封袋，保存于 2-8℃。
3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、編號：將樣本和標(biāo)準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標(biāo)準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。
6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、每孔加入酶標(biāo)記物 100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色 15min。
9、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準液吸光度值分別是：
0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415； 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。
則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準品或樣本的百分 2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見
吸光率等于標(biāo)準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 包裝盒。
孔）除以第一個標(biāo)準（0 標(biāo)準）的吸光度值，再乘 提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正
以 100%，即 常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B
—標(biāo)準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標(biāo)準溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準曲線的繪制與計算以標(biāo)準品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以己烯雌酚標(biāo)
準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù) 即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項
1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～
25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為 37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
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